Общий состав ядерного матрикса
Мы уже познакомились с тем, что в интерфазном ядре развернутые хромосомы располагаются не хаотично, а строго упорядоченно. Такая организация хромосомы в трехмерном пространстве ядра необходима не только для того, чтобы при митозе происходила сегрегация хромосом, их обособление от соседей, но и кроме того необходима для упорядочения процессов репликации и транскрипции хроматина. Можно предполагать, что для осуществления этих задач должна существовать какая-то каркасная внутриядерная система, которая может служить объединяющей основой для всех ядерных компонентов – хроматина, ядрышка, ядерной оболочки. Такой структурой является белковый ядерный остов или матрикс . Необходимо сразу же оговориться, что ядерный матрикс не представляет собой четкой морфологической структуры: он выявляется как отдельный морфологический гетерогенный компонент при экстракции из ядер практически всех участков хроматина, основной массы РНК и липопротеидов ядерной оболочки. От ядра, ĸᴏᴛᴏᴩᴏᴇ не теряет при этом своей общей морфологии, оставаясь сферической структурой, остается как бы каркас, остов, который иногда называют еще «ядерным скелетом».
Впервые компоненты ядерного матрикса (остаточные ядерные белки) были выделены и охарактеризованы в начале 60-х годов. Было обнаружено, что при последовательной обработке изолированных ядер печени крыс 2 М раствором NaCI, а затем ДНКазой, происходит полное растворение хроматина, а основными структурными элементами ядра остаются: ядерная оболочка, связанные с ней компоненты – нуклеонемы (ядерные нити), содержащие белок и РНК, и ядрышки. Была высказана гипотеза, что фибриллы хроматина в нативных ядрах прикреплены к этим осевым белковым нитям наподобие «ершика для чистки бутылок» (см. рис. 67).
Значительно позднее (середина 70-х годов) эти работы получили развитие и привели к появлению массы новых сведений о нехроматиновых белках ядерного остова и о его роли в физиологии клеточного ядра. В это же время был предложен термин «ядерный матрикс» для обозначения остаточных структур ядра, которые бывают получены в результате последовательных экстракций ядер различными растворами. Новым в этих приемах было использование неионных детергентов, таких как Тритон Х-100, растворяющих ядерные липопротеидные мембраны.
Последовательность обработки выделенных ядер, приводящая к получению препаратов ядерного матрикса, обогащенного белком, следующая (см. табл. 6).
Таблица 6. Экстракция (в %) ядерных компонентов в процессе получения ядерного белкового матрикса
Изолированные ядра, полученные в растворах 0,25 М сахарозы, 0,05 М Трис-HCI буфера и 5 мМ MgCI 2 помещались в раствор низкой ионной силы (LS), где деградировала основная масса ДНК за счет эндонуклеазного расщепления. В 2 М NaCI (HS) в дальнейшем происходила диссоциация хроматина на гистоны и ДНК, шла дальнейшая экстракция фрагментов ДНК и различных белков. Последующая обработка ядер в 1% растворе Тритона Х-100 приводила почти к полной потере фосфолипидов ядерной оболочки и получению ядерного матрикса (NM), содержащего остатки ДНК и РНК, которые дополнительно растворялись при обработке нуклеазами, в результате чего получали конечную фракцию ядерного белкового матрикса (NPM). Он состоит на 98% из негистоновых белков, в него, кроме того, входит 0,1% ДНК, 1,2% РНК, 1,1% фосфолипидов.
Химический состав ядерного матрикса, полученный таким способом сходен у различных объектов (см. табл. 7).
Таблица 7. Состав ядерного белкового матрикса
По своей морфологической композиции ядерный матрикс состоит,по крайней мере, из трех компонентов: периферический белковый сетчатый (фиброзный) слой – ламина (nuclear lamina, fibrous lamina), внутренняя или интерхроматиновая сеть (остов) и «остаточное» ядрышко (рис. 68).
Ламина представляет собой тонкий фиброзный слой, подстилающий внутреннюю мембрану ядерной оболочки. В ее состав входят так же комплексы ядерных пор, которые как бы вмурованы в фиброзный слой. Часто эту часть ядерного матрикса называют фракцией «поровый комплекс – ламина» (PCL – “pore complex – lamina”). В интактных клетках и ядрах ламина большей частью морфологически не выявляется, т.к. к ней тесно прилегает слой периферического хроматина. Лишь иногда ее удается наблюдать в виде относительного тонкого (10-20 нм) фиброзного слоя, располагающегося между внутренней мембраной ядерной оболочки и периферическим слоем хроматина.
Структурная роль ламины очень велика: она образует сплошной фиброзный белковый слой по периферии ядра, достаточный для того, чтобы поддерживать морфологическую целостность ядра. Так удаление обеих мембран ядерной оболочки с помощью Тритона Х-100 не вызывает распада, растворения ядер. Οʜᴎ сохраняют свою округлую форму и не расплываются даже в случае перевода их в низкую ионную силу, когда происходит набухание хроматина.
Внутриядерный остов или сеть морфологически выявляется только после экстракции хроматина. Он представлен рыхлой фиброзной сетью, располагающейся между участками хроматина, часто в состав этой губчатой сети входят различные гранулы РНП-природы.
Наконец, третий компонент ядерного матрикса – остаточное ядрышко – плотная структура, повторяющая по своей форме ядрышко, также состоит из плотно уложенных фибрилл.
Морфологическая выраженность этих трех компонентов ядерного матрикса, так же как и количество во фракциях, зависит от целого ряда условий обработки ядер. Лучше всего элементы матрикса выявляются после выделения ядер в относительно высоких (5 мМ) концентрациях двухвалентный катионов.
Обнаружено, что для выявления белкового компонента ядерного матрикса большое значение имеет образование дисульфидных связей. Так если ядра предварительно инкубировать с иодацетамидом, препятствующим образованию S-S связей, а затем вести ступенчатую экстракцию, то ядерный матрикс представлен только комплексом PCL. В случае если же использовать тетратионат натрия, вызывающий замыкание S-S связей, то ядерный матрикс представлен всеми тремя компонентами. В ядрах, предварительно обработанных гипотоническими растворами, выявляются только ламина и остаточные ядрышки.
Все эти наблюдения привели к выводу, что компоненты ядерного матрикса представляют собой не застывшие жесткие структуры, а компоненты, обладающие динамической подвижностью, которые могут меняться не только в зависимости от условий их выделения, но и от функциональных особенностей нативных ядер. Так, к примеру, в зрелых эритроцитах кур весь геном репрессирован и хроматин локализован преимущественно на периферии ядра, в этом случае внутренний матрикс не выявляется, а только ламина с порами. В эритроцитах 5-дневных куриных эмбрионов, ядра которых сохраняют транскрипционную активность, элементы внутреннего матрикса выражены отчетливо.
Как было видно из табл. 7, основной компонент остаточных структур ядра – белок, содержание которого может колебаться от 98 до 88%. Белковый состав ядерного матрикса из разных клеток довольно близок. Характерными для него являются три белка фиброзного слоя, и носящих название ламинов . Кроме этих базовых полипептидов в матриксе присутствует большое количество минорных компонентов с молекулярными массами от 11-13 до 200 кД.
Ламины представлены тремя белками (ламины A, B, C). Два из них, ламины A и C, близки друг к другу иммунологически и по пептидному составу. Ламин B от них отличается тем, что он представляет собой липопротеид и в связи с этим он более прочно связывается с ядерной мембраной. Ламин B остается в связи с мембранами даже во время митоза, тогда как ламины А и С освобождаются при разрушении фиброзного слоя и диффузно распределяются по клетке.
Как оказалось, ламины близки по своему аминокислотному составу промежуточным микрофиламентам (виментиновым и цитокератиновым), входящим в состав цитоскелета. Часто фракция выделенных ядер, а также препараты ядерного матрикса содержат значительные количества промежуточных филаментов, которые остаются связанными с периферией ядра даже после удаления ядерных мембран.
В отличие от промежуточных филаментов ламины при полимеризации не образуют нитчатых структур, а организуются в сети с ортогональным типом укладки молекул. Такие сплошные решетчатые участки, подстилают внутреннюю мембрану ядерной оболочки, могут разбираться при фосфорилировании ламинов, и вновь полимеризоваться при их дефосфорилированиии, что обеспечивает динамичность как этого слоя, так и всей ядерной оболочки.
Молекулярная характеристика белков внутриядерного остова детально еще не разработана. Показано, что в его состав входят ряд белков, принимающих участие в доменной организации ДНК в интерфазном ядре в создании розетковидной, хромомерной формы упаковки хроматина. Предположение о том, что элементы внутреннего матрикса представляют собой сердцевины розеточных структур хромомеров находит подтверждение в том, что полипептидный состав матрикса интерфазных ядер (за исключением белков ламины) и остаточных структур метафазных хромосом (осевые структуры или «скэффолд») практически одинаковы. В обоих случаях эти белки отвечают за поддержание петлевой организации ДНК.
ЯДЕРНЫЙ МАТРИКС слева - схема строения ядер до экстракции; справа - после экстракции; 1 - примембранный белковый слой (ламина) и поровые комплексы; 2 - межхроматиновая белковая сеть матрикса; 3 - белковый матрикс ядрышка
Ядерный матрикс: определение Эухроматин и гетерохроматин ассоциированы внутри ядра с сетью нехроматиновых фибриллярных и гранулярных структур. Еще 50 лет назад было показано существование фракции ядерных белков, образующей в ядре фибриллярную сеть нуклеопротеинов. Термин ядерный матрикс (nuclear matrix) был предложен для этой структуры Berezney и Coffey (1974). В связи с тем, что понятие ядерного матрикса является операционно определяемым, разные авторы включают в его состав различные структуры. Так, в большинстве случаев считается, что ядерный матрикс (остов, scaffold) - это внутриядерная сеть фибриллярных и гранулярных компонентов, периферическая ламина с поровыми комплексами и остаточное ядрышко, участвующие в процессах функционирования генома (инициации синтеза и репликации ДНК, а также в синтезе, процессинге и транспорте РНК), его поддержании и расположении хромосом в ядре.
Матрикс ядерный: структура Белки ДНК РНК Фосфолипиды Некоторые исследования заставляют предположить, что структурное единство ядерного матрикса обусловлено металло-протеиновыми взаимодействиями, подобными имеющим место во время выделения матрикса по методикам, базирующимся на включении ионов кальция или меди, а также магния.
Белковый состав ядерного матрикса очень сильно зависит от способов и условий его выделения. Лишь некоторые из множества матриксных белков выделены и охарактеризованы: Структурные белки - ламин А, ламин В 1, В 2 и ламин С, нуклеопротеин В-23 и белки остаточных hn. RNP-частиц, матрины; Регуляторные белки - негистоновые хромосомные белки, ядерные кислые белки, группа ядерных протеинов с высокой подвижностью (HMG), различные факторы транскрипции и ферменты метаболизма нуклеиновых кислот. Из них особо надо отметить топоизомеразу II , которая также является одним из компонентов матрикса (и метафазных хромосом) и присутствует там в достаточно больших количествах, определяя топологический статус хромосомной ДНК. Последовательность одинаково ориентированных ламинов А, В и С (мол. масса 65 -70 к. Д) образуют ядерную ламину (жесткая структура, подстилающая ядерную мембрану, причастная к организации хроматина). Ядерная ламина контактирует с хроматином и ядерными РНК. В результате ассоциации трех главных полипептидов, путем димерного взаимодействия происходит их укладка в 10 -нм структуры, присоединяющиеся к специфическим белкам ядерной мембраны через С-ламин. Вламин, видимо, связан с определенными участками хромосом. Ламин А осуществляет связь между С и В ламинами. Важной функцией полипептидов ядерного матрикса является дезинтеграция ядерной оболочки в процессе митоза. Матринам (matrins) отводится роль основных структурных белков матрикса в узком смысле. Это матрин 3 (12 k. D, обладает слабо кислыми свойствами), матрин 4 (105 k. D, основной), матрин D-G (60 -75 k. D, основной) и матрин 12 и 13 (42 -48 k. D, обладают кислыми свойствами).
Ядерный матрикс: взаимодействие с ДНК Участки ДНК, специфически связывающиеся с ядерным матриксом, принимают, повидимому важное участие в процессах регуляции активности генов, а также в процессах репликации, сплайсинга РНК и ее переноса из ядра в цитоплазму. Ламины, топоизомеразы II, специальные AT-богатые последовательности связывающие белок 1 (SATB 1) и матрикс свзязывающий фактор-B 1 (SAFB 1), являются ключевыми игроками в фундаментальных ядерных процессах. В эукариотических организмах хроматин прикрепляется к ядерной матрице короткими последовательностями ДНК около 100 -2000 п. о. , это так называемый матрикс связывающий регион (MARs). Сильное взаимодействие между MARs и нерастворимыми белками ядерного матрикса защищает эти последовательности от ионного буфера и нуклеаз. Как правило, MAR/SARпоследовательности фланкируют гены, однако в ряде случаев их обнаруживают и внутри генов, но в составе интронов, а также вблизи энхансеров. Взаимодействия ДНК с ядерным матриксом делятся на: перманентные (то есть присутствующие и в неактивном ядре) функционально-зависимые (временные, динамические) Высшие структуры хроматина интерфазных и метафазных хромосом, вероятно, будут поддерживаться перманентными MARs. Динамические временные объединения MARs будут вовлечены в геномные функции, так как они соотносятся с транскрипцией или репликацией генетического локуса, с которыми они связаны.
MARs и регуляция транскрипции Опишем регуляцию транскрипции на примере Т-клеточной дифференцировки. После стимуляции антигеном, наивный помощник CD 4 T-лимфоцит дифференцируется в эффекторные Th 1 и Th 2 клетки. У мышей, IFNG (ген цитокинов интерферона-γ) будет молчать в наивных Т-лимф-х, но транскрибируется в активированных Th 1 клеток. В наивных Т-лимф-х IFNG существует в линейной конформации, но в Th 1 клетки он присутствует в виде петель, связанных с ядерной матрицей с помощью MARs 7 кб с одной стороны и 14 кб с др. стороны от локуса. Отсутствие селективной привязанности ДНК к ядерной матрице в наивных Тклетках показывает, что динамические связи ДНК с матрицей формируют петли, способствующие экспрессии IFNG локуса. Молекулярные механизмы перманентной связи можно показать на примере локуса, в котором содержится кластер согласованно регулируемых генов IL 4 , IL 13 и IL 5. Эти гены экспрессируются в клетках Th 2, но молчат в наивных Т-лимф-х. После активации Th 2, экспрессия гена SATB 1(специальная AT-богатой последовательностью -связывающий белок-1) быстро индуцируется, и MARs образует мелкие петли, способствующие экспрессии гена. Down-регуляция экспрессии SATB 1 РНКинтерференцией предотвращает как формирование этой петлевой структуры, так и активацию транскрипции локуса. В SATB 1 -null тимоцитах экспрессия многих генов нарушена и Т-клеточное развития в SATB 1 -дефицитных мышей преждевременно блокируется. Эти результаты показывают, что связывание SATB 1 на MARs регулирует экспрессию генов Т-кл дифференцировки по реорганизации хроматина высшего порядка.
Транскрипция в эукариотических клетках В эукариотических клеток синтез м. РНК сосредоточен в очагах внутри ядра, которые содержат РНК-полимеразы, РНК-транскриптазы, факторы транскрипции м. РНК и факторы обработки. Сохранение РНКполимеразы II и общих факторов транскрипции в ядрах после экстракции растворимых белков и нуклеазы, говорит о том, что транскрипционные факторы собрались на ядерном матриксе. Предполагают, что динамические взаимодействия между MARs и матриксом объединяет проксимальные и дистальные регуляторные последовательности и собирает их близко к факторам транскрипции, тем самым способствуя эффективной регуляции экспрессии генов. Связь MARs и ядерного матрикса топологически ограничивает ДНК в петлю структур, защищая промежуточные ДНК от влияния цисрегуляторных элементов. Таким образом, можно говорить, что MARs выполняет такие функции, как платформа для широкого спектра матричных протеинов Такие взаимодействия образуют сложные нуклеопротеидные структуры, которые: изолируют домены хроматина регулируют экспрессию генов
Упрощенная модель изображающая функцию MARs в регуляции генов Активация транскрипции сопровождается закрепления MARs ядерного матрикса. Это приводит к формированию петель. Транскрипционный комплекс собирается на месте MARs. Взаимодействие MARs с ядерным матриксом объединяет кодирующие последовательности, регуляторные элементы ДНК и факторы транскрипции. В конце фазы S, транскрипционный комплекс разрушается.
MARs и репликация Чтобы убедиться, что геном копируется точно, и только один раз за клеточный цикл, эукариоты развили сложные механизмы регулирования репликации ДНК. В очаге репликации, ядерный матрикс содержит факторы, необходимые для репликации ДНК: ДНК-полимеразы ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA) однонитевой связывающий белок (RPA) Считается, что выбор и размер репликона определяется в ранней G 1 фазе. MCM 2 (фактор лицензирования ДНК репликации), ORC 1, 2 (origin recognition complex) загружаются в репликативный комплекс постепенно, но быстро исключаются в S фазу. Это соответствует модели, в которой MARs стабильно закрепляет концы репликона, а во время G 1 происходит присоединение Oris к ядерной матрице, где матрице накапливаются факторы для формирования предварительного репликативного комплекса. Впоследствии, как число Oris увеличивается в фазе S, определенные белковые факторы отсоединяются от хроматина и проходят протеолиз - как часть механизма управления, чтобы предотвратить повторную репликацию - таким образом освобождая Oris от ядерного матрикса. На концах репликона, MARs может выступать в качестве барьеров между соседними репликонами, предотвращая накопление суперспирализованной структуры ДНК, обеспечивая при этом сайты связывания для топоизомеразы II, которая может разрешить репликацию промежуточных продуктов.
Схема репликации ДНК на ядерной матрице (а) Репликоны определены в ранней фазе G 1 клеточного цикла путем присоединения MARs к ядерному матриксу. (б) В конце G 1 - начало репликации (Oris) - собираются факторы репликации на этих сайтах (с) Как только необходимые митогенные стимулы были получены, клетки вступают в фазу S, на котором Oris активизируются. После инициации репликации в определенном локусе, факторы инициации отмежеваються от ядерного матрикса. Две петли репликации ДНК постепенно появляются (показаны синим цветом) (d) В конце фазы S, репликативные комплексы разрушаются.
Липиды ядерного матрикса Фосфолипиды (сфингомиелин – обычно преобладает, ФХ, ФЭ, кардиолипин (у крыс)); Нейтральные липиды (свободный холестерин, много триглицеридов и свободных жирных кислот, мало эфиров холестерина, а диглицериды вообще отсутствуют (у крыс)). Предполагают два типа контактов петель ДНК с ядерным матриксом: Øдинамичный - функциональный, за счет фосфолипидов, возможно, кардиолипина и сфингомиелина, через его сфингозиновую группу (участие сфингомиелина в точках инициации репликации ДНК на матриксе, тем более, что сфингомиелин оказывает сильный дестабилизирующий эффект на вторичную структуру ДНК); Øстабильный - прочный за счет нейтральных липидов (регуляции синтеза нуклеиновых кислот как на уровне модификации активности протеинкиназы С, так и в результате взаимодействия с матрицей ДНК (жирные кислоты, холестерин)).
Этот комплекс не представляет собой какую-то чистую фракцию, сюда входят компоненты и ядерной оболочки, и ядрышка, и кариоплазмы. С ядерным матриксом оказались связаны как гетерогенная РНК, так и часть ДНК. Эти наблюдения дали основание считать, что матрикс ядра играет важную роль не только в поддержании общей структуры интерфазного ядра, но и может участвовать в регуляции синтеза нуклеиновых кислот.
При наблюдении некоторых живых клеток, особенно растительных или же клеток после фиксации и окраски, внутри ядра выявляются зоны плотного вещества. В состав хроматина входит ДНК в комплексе с белком. В интерфазных клетках хроматин может равномерно заполнять объем ядра или же располагаться отдельными сгустками (хромоцентры). Часто он особенно четко выявляется на периферии ядра (пристеночный, примембранный хроматин) или образует внутри ядра переплетения довольно толстых (около 0.3 мкм) и длинных тяжей, образующих подобие внутриядерной цепи.
Хроматин интерфазных ядер представляет собой несущие ДНК тельца (хромосомы), которые теряют в это время свою компактную форму, разрыхляются, деконденсируются. Степень такой деконденсации хромосом может быть различной в ядрах разных клеток. Когда хромосома или ее участок полностью деконденсирован, тогда эти зоны называют диффузным хроматином. При неполном разрыхлении хромосом в интерфазном ядре видны участки конденсированного хроматина (иногда называемого гетерохроматин). Показано, что степень деконденсации хромосомного материала в интерфазе может отражать функциональную нагрузку этой структуры. Чем более диффузен хроматин интерфазного ядра, тем выше в нем синтетические процессы. Падение синтеза РНК в клетках обычно сопровождается увеличением зон конденсированного хроматина.
Максимально конденсирован хроматин во время митотического деления клеток, когда он обнаруживается в виде плотных телец - хромосом. В этот период хромосомы не несут никаких синтетических нагрузок, в них не происходит включение предшественников ДНК и РНК.
в рабочем, частично или полностью деконденсированном, когда с их участием в интерфазном ядре происходят процессы транскрипции и редупликации;
в неактивном - в состоянии метаболического покоя при максимальной их конденсированности, когда они выполняют функцию распределения и перенося генетического материала в дочерние клетки.
В химическом отношении препараты хроматина представляют собой сложные комплексы дезоксирибонуклеопротеидов, в состав которых входит ДНК и специальные хромосомные белки - гистоны. В составе хроматина обнаружено также РНК. В количественном отношении ДНК, белок и РНК находятся как 1:1,3:0,2. О значении РНК в составе хроматина еще нет достаточно однозначных данных. Возможно, что эта РНК представляет собой сопутствующую препарату функцию синтезирующейся РНК и поэтому частично связанной с ДНК или это особый вид РНК, характерный для структуры хроматина.
Мы уже познакомились с тем, что в интерфазном ядре развернутые хромосомы располагаются не хаотично, а строго упорядоченно. Такая организация хромосомы в трехмерном пространстве ядра необходима не только для того, чтобы при митозе происходила сегрегация хромосом, их обособление от соседей, но и кроме того необходима для упорядочения процессов репликации и транскрипции хроматина. Можно предполагать, что для осуществления этих задач должна существовать какая-то каркасная внутриядерная система, которая может служить объединяющей основой для всех ядерных компонентов – хроматина, ядрышка, ядерной оболочки. Такой структурой является белковый ядерный остов или матрикс . Необходимо сразу же оговориться, что ядерный матрикс не представляет собой четкой морфологической структуры: он выявляется как отдельный морфологический гетерогенный компонент при экстракции из ядер практически всех участков хроматина, основной массы РНК и липопротеидов ядерной оболочки. От ядра, которое не теряет при этом своей общей морфологии, оставаясь сферической структурой, остается как бы каркас, остов, который иногда называют еще «ядерным скелетом».
Впервые компоненты ядерного матрикса (остаточные ядерные белки) были выделены и охарактеризованы в начале 60-х годов. Было обнаружено, что при последовательной обработке изолированных ядер печени крыс 2 М раствором NaCI, а затем ДНКазой, происходит полное растворение хроматина, а основными структурными элементами ядра остаются: ядерная оболочка, связанные с ней компоненты – нуклеонемы (ядерные нити), содержащие белок и РНК, и ядрышки. Была высказана гипотеза, что фибриллы хроматина в нативных ядрах прикреплены к этим осевым белковым нитям наподобие «ершика для чистки бутылок» (см. рис. 67).
Значительно позднее (середина 70-х годов) эти работы получили развитие и привели к появлению массы новых сведений о нехроматиновых белках ядерного остова и о его роли в физиологии клеточного ядра. В это же время был предложен термин «ядерный матрикс» для обозначения остаточных структур ядра, которые могут быть получены в результате последовательных экстракций ядер различными растворами. Новым в этих приемах было использование неионных детергентов, таких как Тритон Х-100, растворяющих ядерные липопротеидные мембраны.
Последовательность обработки выделенных ядер, приводящая к получению препаратов ядерного матрикса, обогащенного белком, следующая (см. табл. 6).
Таблица 6 . Экстракция (в %) ядерных компонентов в процессе получения ядерного белкового матрикса
Изолированные ядра, полученные в растворах 0,25 М сахарозы, 0,05 М Трис-HCI буфера и 5 мМ MgCI 2 помещались в раствор низкой ионной силы (LS), где деградировала основная масса ДНК за счет эндонуклеазного расщепления. В 2 М NaCI (HS) в дальнейшем происходила диссоциация хроматина на гистоны и ДНК, шла дальнейшая экстракция фрагментов ДНК и различных белков. Последующая обработка ядер в 1% растворе Тритона Х-100 приводила почти к полной потере фосфолипидов ядерной оболочки и получению ядерного матрикса (NM), содержащего остатки ДНК и РНК, которые дополнительно растворялись при обработке нуклеазами, в результате чего получали конечную фракцию ядерного белкового матрикса (NPM). Он состоит на 98% из негистоновых белков, в него, кроме того, входит 0,1% ДНК, 1,2% РНК, 1,1% фосфолипидов.
Химический состав ядерного матрикса, полученный таким способом сходен у различных объектов (см. табл. 7).
Таблица 7 . Состав ядерного белкового матрикса
По своей морфологической композиции ядерный матрикс состоит,по крайней мере, из трех компонентов: периферический белковый сетчатый (фиброзный) слой – ламина (nuclear lamina, fibrous lamina), внутренняя или интерхроматиновая сеть (остов) и «остаточное» ядрышко (рис. 68).
Ламина представляет собой тонкий фиброзный слой, подстилающий внутреннюю мембрану ядерной оболочки. В ее состав входят так же комплексы ядерных пор, которые как бы вмурованы в фиброзный слой. Часто эту часть ядерного матрикса называют фракцией «поровый комплекс – ламина» (PCL – “pore complex – lamina”). В интактных клетках и ядрах ламина большей частью морфологически не выявляется, т.к. к ней тесно прилегает слой периферического хроматина. Лишь иногда ее удается наблюдать в виде относительного тонкого (10-20 нм) фиброзного слоя, располагающегося между внутренней мембраной ядерной оболочки и периферическим слоем хроматина.
Структурная роль ламины очень велика: она образует сплошной фиброзный белковый слой по периферии ядра, достаточный для того, чтобы поддерживать морфологическую целостность ядра. Так удаление обеих мембран ядерной оболочки с помощью Тритона Х-100 не вызывает распада, растворения ядер. Они сохраняют свою округлую форму и не расплываются даже в случае перевода их в низкую ионную силу, когда происходит набухание хроматина.
Внутриядерный остов или сеть морфологически выявляется только после экстракции хроматина. Он представлен рыхлой фиброзной сетью, располагающейся между участками хроматина, часто в состав этой губчатой сети входят различные гранулы РНП-природы.
Наконец, третий компонент ядерного матрикса – остаточное ядрышко – плотная структура, повторяющая по своей форме ядрышко, также состоит из плотно уложенных фибрилл.
Морфологическая выраженность этих трех компонентов ядерного матрикса, так же как и количество во фракциях, зависит от целого ряда условий обработки ядер. Лучше всего элементы матрикса выявляются после выделения ядер в относительно высоких (5 мМ) концентрациях двухвалентный катионов.
Обнаружено, что для выявления белкового компонента ядерного матрикса большое значение имеет образование дисульфидных связей. Так если ядра предварительно инкубировать с иодацетамидом, препятствующим образованию S-S связей, а затем вести ступенчатую экстракцию, то ядерный матрикс представлен только комплексом PCL. Если же использовать тетратионат натрия, вызывающий замыкание S-S связей, то ядерный матрикс представлен всеми тремя компонентами. В ядрах, предварительно обработанных гипотоническими растворами, выявляются только ламина и остаточные ядрышки.
Все эти наблюдения привели к выводу, что компоненты ядерного матрикса представляют собой не застывшие жесткие структуры, а компоненты, обладающие динамической подвижностью, которые могут меняться не только в зависимости от условий их выделения, но и от функциональных особенностей нативных ядер. Так, например, в зрелых эритроцитах кур весь геном репрессирован и хроматин локализован преимущественно на периферии ядра, в этом случае внутренний матрикс не выявляется, а только ламина с порами. В эритроцитах 5-дневных куриных эмбрионов, ядра которых сохраняют транскрипционную активность, элементы внутреннего матрикса выражены отчетливо.
Как было видно из табл. 7, основной компонент остаточных структур ядра – белок, содержание которого может колебаться от 98 до 88%. Белковый состав ядерного матрикса из разных клеток довольно близок. Характерными для него являются три белка фиброзного слоя, и носящих название ламинов . Кроме этих основных полипептидов в матриксе присутствует большое количество минорных компонентов с молекулярными массами от 11-13 до 200 кД.
Ламины представлены тремя белками (ламины A, B, C). Два из них, ламины A и C, близки друг к другу иммунологически и по пептидному составу. Ламин B от них отличается тем, что он представляет собой липопротеид и поэтому он более прочно связывается с ядерной мембраной. Ламин B остается в связи с мембранами даже во время митоза, тогда как ламины А и С освобождаются при разрушении фиброзного слоя и диффузно распределяются по клетке.
Как оказалось, ламины близки по своему аминокислотному составу промежуточным микрофиламентам (виментиновым и цитокератиновым), входящим в состав цитоскелета. Часто фракция выделенных ядер, а также препараты ядерного матрикса содержат значительные количества промежуточных филаментов, которые остаются связанными с периферией ядра даже после удаления ядерных мембран.
В отличие от промежуточных филаментов ламины при полимеризации не образуют нитчатых структур, а организуются в сети с ортогональным типом укладки молекул. Такие сплошные решетчатые участки, подстилают внутреннюю мембрану ядерной оболочки, могут разбираться при фосфорилировании ламинов, и вновь полимеризоваться при их дефосфорилированиии, что обеспечивает динамичность как этого слоя, так и всей ядерной оболочки.
Молекулярная характеристика белков внутриядерного остова детально еще не разработана. Показано, что в его состав входят ряд белков, принимающих участие в доменной организации ДНК в интерфазном ядре в создании розетковидной, хромомерной формы упаковки хроматина. Предположение о том, что элементы внутреннего матрикса представляют собой сердцевины розеточных структур хромомеров находит подтверждение в том, что полипептидный состав матрикса интерфазных ядер (за исключением белков ламины) и остаточных структур метафазных хромосом (осевые структуры или «скэффолд») практически одинаковы. В обоих случаях эти белки отвечают за поддержание петлевой организации ДНК.
Ядро клетки - центральный органоид, один из самых важных. Наличие его в клетке является признаком высокой организации организма. Клетка, имеющая оформленное ядро, называется эукариотической. Прокариоты - это организмы, состоящие из клетки, не имеющей оформленного ядра. Если подробно рассмотреть все его составляющие, то можно понять, какую функцию выполняет ядро клетки.
Структура и функции ядра клетки зависят от типа клеток и их предназначения.
Ядерная оболочка имеет две мембраны - внешнюю и внутреннюю. Они разделены между собой перинуклеарным пространством. Оболочка имеет поры. Ядерные поры необходимы для того, чтобы различные крупные частицы и молекулы могли перемещаться из цитоплазмы в ядро и обратно.
Ядерные поры образуются в результате слияния внутренней и наружной мембраны. Поры представляют собой округлые отверстия, имеющие комплексы, в которые входят:
Количество пор в ядерной оболочке зависит от того, насколько интенсивно в клетке проходят синтетические процессы.
Ядерная оболочка состоит из внешней и внутренней мембран. Внешняя переходит в шероховатый ЭПР (эндоплазматический ретикулум).
Хроматин - важнейшее вещество, входящее в ядро клетки. Функции его - это хранение генетической информации. Он представлен эухроматином и гетерохроматином. Весь хроматин - это совокупность хромосом.
Эухроматин - это части хромосом, которые активно принимают участие в транскрипции. Такие хромосомы находятся в диффузном состоянии.
Неактивные отделы и целые хромосомы представляют собой конденсированные глыбки. Это и есть гетерохроматин. При изменении состояния клетки гетерохроматин может переходить в эухроматин, и наоборот. Чем больше в ядре гетерохроматина, тем ниже скорость синтеза рибонуклеиновой кислоты (РНК) и тем меньше функциональная активность ядра.
Хромосомы - это особые образования, которые возникают в ядре только во время деления. Хромосома состоит из двух плеч и центромеры. По форме их делят на:
У каждого вида количество хромосом всегда одинаково, но стоит отметить, что от их количества не зависит уровень организации организма. Так, у человека имеется 46 хромосом, у курицы - 78, у ежа - 96, а у березы - 84. Наибольшее число хромосом имеет папоротник Ophioglossum reticulatum. У него 1260 хромосом на каждую клетку. Наименьшее число хромосом имеет самец-муравей вида Myrmecia pilosula. У него только 1 хромосома.
Именно изучив хромосомы, ученые поняли, каковы функции ядра клетки.
В состав хромосом входят гены.
Гены - это участки молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), в которых закодированы определенные составы молекул белка. В результате этого у организма проявляется тот или иной признак. Ген передается по наследству. Так, ядро в клетке выполняет функцию передачи генетического материала следующим поколениям клеток.
Нуклеола - это самая плотная часть, которая входит в ядро клетки. Функции, которые она выполняет, очень важны для всей клетки. Обычно имеет округлую форму. Количество ядрышек варьируется в разных клетках - их может быть два, три либо вооще не быть. Так, в клетках дробящихся яиц нуклеолы нет.
Структура ядрышка:
Фибриллярные центры (ФЦ) - это участки фибрилл, имеющие низкую плотность, которые, в свою очередь, окружены фибриллами с высокой плотностью. Химический состав и строение ФЦ почти такие же, как и у ядрышковых организаторов митотических хромосом. В их состав входят фибриллы толщиной до 10 нм, в которых есть РНК-полимераза I. Это подтверждается тем, что фибриллы окрашиваются солями серебра.
Почти 60% сухого веса ядрышек приходится на белки. Их количество очень велико и может достигать нескольких сотен.
Главная функция ядрышек - это синтез рРНК. Зародыши рибосом попадают в кариоплазму, затем через поры ядра просачиваются в цитоплазму и на ЭПС.
Ядерный матрикс занимает почти все ядро клетки. Функции его специфичны. Он растворяет и равномерно распределяет все нуклеиновые кислоты в состоянии интерфазы.
Ядерный матрикс, или кариоплазма, - это раствор, в состав которого входят углеводы, соли, белки и другие неорганические и органические вещества. В нем содержатся нуклеиновые кислоты: ДНК, тРНК, рРНК, иРНК.
В состоянии деления клетки ядерная оболочка растворяется, образуются хромосомы, а кариоплазма смешивается с цитоплазмой.
Один из самых важных органоидов - ядро клетки. Функции его важны для нормальной жизнедеятельности всего организма.
